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实验报告：

一、分离与培养
：

1
、无菌条件下
，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织，然后用PBS将此组织块清洗2次，将组织剪成1mm3左右大小
；

2
、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型胶原酶）
，混悬10s
，置37℃条件下消化10min
，之后用滴管吹打制成单细胞悬液
，自然沉淀并收集上清
，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置；

3、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液，混悬10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置

，重复此步骤2-3次，直至组织被消化；

4
、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液
，1200r/min 离心10min
，弃去上清，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬，接种于25cm2培养瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培养箱中培养；

5
、差速贴壁1h后，吸出培养基，按实验需要接种于6孔板中继续培养；二、免疫荧光鉴定：

1、待心房肌细胞生长至80%融合时，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次

，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min；

2、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在4℃条件下
，用0.1％Triton X-100透膜15min
；

3
、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在室温条件下，用4% BSA封闭细胞30min；

4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗，然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜
；

5、PBS冲洗细胞3次，每次10min，按1：150的比例稀释抗α-actin的二抗
， 37℃条件下放置1h；

6、用PBS冲洗3次，每次10min

，在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照。

细胞简介：

小鼠肺微血管平滑肌分离自肺组织；肺是机体的呼吸器官
，位于胸腔，左右各一
，覆盖于心之上。肺有分叶，左二右三，共五叶

。肺经肺系（指气管、支气管等）与喉、鼻相连
，故称喉为肺之门户，鼻为肺之外窍
。肺血管平滑肌细胞原代分离培养3天后，可见细胞贴壁伸展

，细胞形态大小不一
，呈梭形、不规则形
、三角形或扇形，核卵圆形、居中；2周后细胞汇合
，多数细胞伸展呈长梭形，胞浆丰富，有分枝状突起
，细胞平行排列成单层或部分区域多层重叠生长，高低起伏
；细胞密度低时
，常交织成网状；密度高时
，则排列为旋涡状或栅栏状
。传代后细胞生长较快
，4-6天即可汇合，并保持上述形态学特征和生长特点
。肺血管平滑肌细胞主要功能
：①细胞表面表达介质（ICAM-1和VCAM-1）参与血管壁炎症反应
；②是多数重要动脉疾病的靶细胞
。肺血管平滑肌细胞与主要病生理变化：①平滑肌增生易致肺动脉高压；②先天性肺动脉狭窄
；③肺动脉栓塞。血管平滑肌细胞的加速生长潜能是血管疾病进展的关键因素，新研究表明血管平滑肌细胞表达的ICAM-1和VCAM-1能促进血管壁的炎症反应，并且与血管疾病的发展及稳定性有关
。

方法简介：

实验室分离的小鼠肺微血管平滑肌采用混合胶原酶消化法制备而来，细胞总量约为5×10⁵cells/瓶
。

质量检测

实验室分离的小鼠肺微血管平滑肌经α-SMA免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上
，且不含有HIV-1
、HBV
、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等。

培养信息：

培养基

：基础培养基，含FBS、EGF、bFGF
、IGF、VEGF、Heparin、Hydrocortisone
、Penicillin、Streptomycin等

换液频率：每2-3天换液一次

生长特性：贴壁

细胞形态
：成纤维细胞样

传代特性：可传1-2代左右

消化液
：0.25%

培养条件：气相

：空气
，95%
；CO2
，5%

小鼠肺微血管平滑肌体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养
，以此保证该细胞的佳培养状态。

注意事项：

1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液
、浑浊等现象

，若有上述现象发生请及时和242net必赢联系。

2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等
，确保细胞培养条件一致，若由于培养条件不一致而导致细胞出现问题，责任由客户自行承担。

3. 用75%酒精擦拭细胞瓶表面
，显微镜下观察细胞状态。因运输问题
，部分细胞由于温度变化及剧烈碰亡破碎形成碎片
，是正常现象。观察好细胞状态后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置4-6h。

4. 贴壁细胞可以消化
，悬浮细胞直接混匀收集细胞，900 rpm-1000 rpm离心3 min
，弃上清
。加5 mL PBS重悬细胞，再900 rpm-1000 rpm离心3 min
，
，用新鲜的*培养基重悬细胞，并接种到新的培养瓶或培养皿中，置于培养箱中进行培养。

5. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。

6. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态
，便于和我司技术部沟通交流。由于运输的原因，个别敏感细胞会出现不稳定的情况，请及时和242net必赢联系
，告知细胞的具体情况
，以便242net必赢的技术人员跟踪回访直至问题解决。

7. 该细胞仅供科研使用。

8. 备注：运输用的培养基(灌液培养基)不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的*培养基来培养细胞

。收到细胞后次传代建议1
：2传代
。

9.注意： 1:2传代就是1个T25瓶传2个T25瓶或者2个6cm皿
。不是1个T25瓶传2个10cm皿。

公司正在出售的产品
：

大鼠Ⅴ型胶原(Col Ⅴ)检测试剂盒 ，英文名： Col Ⅴ ELISA Kit

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：2-8℃   保质期：6个月。

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。

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：兔子脑素试剂盒、兔子脑素检测试剂盒   保存条件：2-8℃   保质期
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。