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实验报告：

一
、分离与培养：

1、无菌条件下
，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织，然后用PBS将此组织块清洗2次，将组织剪成1mm3左右大小；

2
、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型胶原酶），混悬10s
，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液，自然沉淀并收集上清
，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置；

3、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液
，混悬10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置，重复此步骤2-3次，直至组织被消化
；

4
、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液，1200r/min 离心10min，弃去上清
，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬
，接种于25cm2培养瓶
，放置于37℃ 
，5％CO2 培养箱中培养
；

5、差速贴壁1h后
，吸出培养基
，按实验需要接种于6孔板中继续培养；二、免疫荧光鉴定：

1、待心房肌细胞生长至80%融合时，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次，每次10min
，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min；

2、PBS冲洗细胞2次
，每次10min
，然后在4℃条件下
，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3
、PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后在室温条件下
，用4% BSA封闭细胞30min
；

4
、按1: 100的比例稀释α-actin一抗，然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜；

5、PBS冲洗细胞3次

，每次10min，按1：150的比例稀释抗α-actin的二抗
， 37℃条件下放置1h
；

6、用PBS冲洗3次，每次10min
，在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照。

细胞简介：

人骨髓树突状分离自骨髓；骨髓是机体的造血组织
，位于身体的许多骨骼内
。成年动物的骨髓分两种：红骨髓和黄骨髓。红骨髓能制造红细胞
、血小板和各种白细胞。血小板有止血作用，白细胞能杀灭与抑制各种病原体，包括细菌、病毒等；某些淋巴细胞能制造抗体。因此，骨髓不但是造血器官
，它还是重要的免疫器官。骨髓是存在于长骨(如肱骨、股骨)的骨髓腔和扁平骨(如髂骨)的稀松骨质间的网眼中，是一种海绵状的组织
，能产生血细胞的骨髓略呈红色，称为红骨髓。出生时，红骨髓充满全身骨髓腔，随着年龄增大，脂肪细胞增多，相当部分红骨髓被黄骨髓取代
，后几乎只有扁平骨骨髓腔中有红骨髓。骨髓DC细胞是由骨髓单核细胞诱导而成的

；树突状细胞分为成熟树突状细胞和未成熟树突状细胞，典型的未成熟树突状细胞呈半贴壁生长，在GM-CSF
、IL4的作用下形成葡萄串样集落
，细胞大而形态不规则，表面皱褶多，亦可见少量短刺状突，胞内细胞器丰富并可见吞噬泡，具有较强的迁移能力，伴随有部分未诱导成的单核细胞
，贴壁形态多样。而成熟的树突状细胞由未成熟DC进一步经TNFα
、LPS等诱导而成，多数呈悬浮生长
， 细胞呈圆形，细胞体积进一步增大
，表面大量粗细不等的树枝样突起(高倍镜或者电镜下可观察到 )，伴随少量贴壁未成熟细胞或者单核细胞。未成熟DC细胞长时间培养也可能导致自发分化成熟。DC细胞尚无特异性细胞表面分子标志，主要通过形态学、组合性细胞表面标志、在混合淋巴细胞反应中能激活初始T细胞等特征进行鉴定。其中成熟树突状细胞表面高表达主要组织相容性复合物(MHC)以及CD80、CD86等共刺激分子，进而激活T淋巴细胞，诱导免疫应答
，处于启动、调控
、并维持免疫应答的中心环节；未成熟树突状细胞具有很强的抗原摄取加工能力
，但由于缺乏多种共刺激分子不能使初始T细胞活化
、增殖产生免疫应答
，不能激活T细胞的信号，可导致T细胞无能，从而诱导免疫低反应或抗原免疫特异性耐受
。未成熟树突状细胞表面CD80、CD86
、MHC-Ⅱ类分子等共刺激分子表达较低，一般在30%以下。

方法简介：

实验室分离的人骨髓成熟DC采用密度梯度离心法分离骨髓单个核细胞、培养过程添加细胞因子诱导而来，细胞总量约为5×10⁵cells/瓶
。

质量检测

实验室分离的人骨髓树突状(成熟DC细胞)经CD86免疫荧光鉴定
、细 胞 形态等综合鉴定
，纯度可达80%以上，且不含有HIV-1
、HBV
、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等
。

培养信息：

培养基
：含FBS、生长添加剂、Penicillin、Streptomycin等

换液频率
：每2-3天换液一次

生长特性
：半贴壁半悬浮

细胞形态：圆形，树突状

传代特性：属于高度分化细胞
；属于不增殖细胞群

消化液：0.25%

培养条件：气相：空气，95%
；CO2，5%

人骨髓树突状(成熟DC细胞)体外培养周期有限
；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的佳培养状态
。

注意事项
：

1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液

、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和242net必赢联系
。

2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息

，如细胞形态、所用培养基、血清比例
、所需细胞因子等
，确保细胞培养条件一致
，若由于培养条件不一致而导致细胞出现问题，责任由客户自行承担。

3. 用75%酒精擦拭细胞瓶表面，显微镜下观察细胞状态
。因运输问题，部分细胞由于温度变化及剧烈碰亡破碎形成碎片，是正常现象。观察好细胞状态后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置4-6h
。

4. 贴壁细胞可以消化，悬浮细胞直接混匀收集细胞
，900 rpm-1000 rpm离心3 min，弃上清。加5 mL PBS重悬细胞，再900 rpm-1000 rpm离心3 min，
，用新鲜的*培养基重悬细胞，并接种到新的培养瓶或培养皿中

，置于培养箱中进行培养。

5. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。

6. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片
，记录细胞状态
，便于和我司技术部沟通交流。由于运输的原因，个别敏感细胞会出现不稳定的情况，请及时和242net必赢联系，告知细胞的具体情况，以便242net必赢的技术人员跟踪回访直至问题解决。

7. 该细胞仅供科研使用。

8. 备注
：运输用的培养基(灌液培养基)不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的*培养基来培养细胞


。收到细胞后次传代建议1：2传代 。

9.注意： 1:2传代就是1个T25瓶传2个T25瓶或者2个6cm皿。不是1个T25瓶传2个10cm皿。

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