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实验报告：

一、分离与培养


：

1、无菌条件下
，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织
，然后用PBS将此组织块清洗2次

，将组织剪成1mm3左右大小
；

2、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型胶原酶）
，混悬10s，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液，自然沉淀并收集上清
，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置；

3
、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液
，混悬10s
，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置，重复此步骤2-3次
，直至组织被消化
；

4
、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液，1200r/min 离心10min，弃去上清，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬，接种于25cm2培养瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培养箱中培养
；

5、差速贴壁1h后
，吸出培养基，按实验需要接种于6孔板中继续培养

；二
、免疫荧光鉴定
：

1
、待心房肌细胞生长至80%融合时，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次
，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min
；

2、PBS冲洗细胞2次，每次10min
，然后在4℃条件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS冲洗细胞2次，每次10min
，然后在室温条件下
，用4% BSA封闭细胞30min；

4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗，然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜；

5、PBS冲洗细胞3次，每次10min
，按1：150的比例稀释抗α-actin的二抗， 37℃条件下放置1h；

6、用PBS冲洗3次，每次10min
，在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照
。

细胞简介
：

大鼠外周血巨噬分离自外周血；外周血是除骨髓之外的血液
，临床上常用一些方法把骨髓中的造血干细胞释放到血液中
，再在从血液中提取分离得到造血干细胞，242net必赢把这样得到的干细胞称为外周血干细胞，在二十一世纪初人类开始的生命方舟计划中提出外周血这一新概念。巨噬细胞属免疫细胞，有多种功能
，是研究细胞吞噬、细胞免疫和分子免疫学的重要对象
。巨噬细胞较易获得，便于培养，并可进行纯化。巨噬细胞属不繁殖细胞群，在条件适宜下可生活2-3周，多用做原代培养

，难以长期生存
。巨噬细胞（Macrophages）是一种位于组织内的白血球，源自单核细胞
，而单核细胞又来源于骨髓中的前体细胞。巨噬细胞和单核细胞皆为吞噬细胞
，在脊椎动物体内参与非特异性防卫（先天性免疫）和特异性防卫（细胞免疫）
。它们的主要功能是以固定细胞或游离细胞的形式对细胞残片及病原体进行噬菌作用（即吞噬以及消化），并激活淋巴球或其他免疫细胞
，令其对病原体作出反应。

方法简介
：

实验室分离的大鼠外周血巨噬采用取外周血
、通过密度梯度离心法、差速贴壁、细胞因子诱导法制备而来，细胞总量约为5×10⁵cells/瓶。

质量检测

实验室分离的大鼠外周血巨噬经CD68免疫荧光鉴定，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV
、支原体、细菌
、酵母和真菌等
。

培养信息：

培养基：含FBS、M-CSF
、Penicillin、Streptomycin等

换液频率：每2-3天换液一次

生长特性
：贴壁

细胞形态：巨噬细胞样

传代特性
：属于终末分化细胞
；属于不增殖细胞群

消化液：（12mM）

培养条件
：气相：空气

，95%

；CO2
，5%

大鼠外周血巨噬体外培养周期有限；建议使用配套的专用生长培养基及正确的操作方法来培养，以此保证该细胞的佳培养状态
。

注意事项
：

1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液
、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和242net必赢联系。

2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基、血清比例、所需细胞因子等

，确保细胞培养条件一致，若由于培养条件不一致而导致细胞出现问题，责任由客户自行承担。

3. 用75%酒精擦拭细胞瓶表面，显微镜下观察细胞状态。因运输问题，部分细胞由于温度变化及剧烈碰亡破碎形成碎片，是正常现象
。观察好细胞状态后，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置4-6h。

4. 贴壁细胞可以消化
，悬浮细胞直接混匀收集细胞
，900 rpm-1000 rpm离心3 min，弃上清
。加5 mL PBS重悬细胞，再900 rpm-1000 rpm离心3 min，
，用新鲜的*培养基重悬细胞，并接种到新的培养瓶或培养皿中
，置于培养箱中进行培养
。

5. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养
。

6. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态，便于和我司技术部沟通交流。由于运输的原因
，个别敏感细胞会出现不稳定的情况，请及时和242net必赢联系

，告知细胞的具体情况，以便242net必赢的技术人员跟踪回访直至问题解决。

7. 该细胞仅供科研使用。

8. 备注：运输用的培养基(灌液培养基)不能再用来培养细胞，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的*培养基来培养细胞。收到细胞后次传代建议1
：2传代 
。

9.注意： 1:2传代就是1个T25瓶传2个T25瓶或者2个6cm皿。不是1个T25瓶传2个10cm皿。

公司正在出售的产品
：

大鼠骨成型蛋白7(BMP-7)检测试剂盒 ，英文名： BMP-7 ELISA Kit

Porcine collagen type III (Col III) ELISA Kit 猪Ⅲ型胶原(Col Ⅲ)检测试剂盒

1型脊髓灰质病毒(PV-1)核酸检测试剂盒(PCR-荧光探针法) 48T

CLIAKitforMK(HumanMidkine)ELISAKit人中期因子

体液脊髓过氧化酶(MPO)活性高质敏感比色法定量检测试剂盒20次

ELISAKitLH犬促黄体生成激素

TNF重组食蟹猴 TNF-alpha / TNFA 蛋白 Protein

HSP-90 Alpha(Heat Shock Protein 90 Alpha 0.5mgHSP-90 Alpha(Heat Shock Protein 90 Alpha ) 热休克蛋白90α抗体

MGAT5重组人 MGAT5 / GGNT5 蛋白 Protein

CD3E Protein Human 重组人 CD3e / CD3 epsilon 蛋白 (His & Fc 标签)

FST Protein Mouse 重组小鼠 Follistatin / FST 蛋白

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小鼠血管性血友病因子/瑞斯托霉素辅因子(vWF)ELISA 试剂盒 96T/48T

Dipeptidyl peptidase IV in two rats (DPP IV) ELISA Kit 大鼠二肽基肽酶Ⅳ(DPPⅣ)检测试剂盒

HumanImmuneRNA,IrnaELISAKit 人免疫核糖核酸(Irna)检测试剂盒 96T/48T 进口分装

抗抗体IgM(间接法二步法)

硬组织固着液(Susa固着液)50毫升

MouseIerleukin1,IL-1ELISAKit小鼠白介素1(IL-1)检测试剂盒规格：96T/48T

大鼠外周血巨噬细胞小鼠胰淀素(Amylin)ELISAKit   ELISA.   96T/48T

小鼠游离状腺原酸(Free-T3)ELISAKit   ELISA.   96T/48T

小鼠白三烯C4(LTC4)ELISAKit   ELISA.   96T/48T

小鼠(Cyt-C)ELISAKit   ELISA.   96T/48T