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实验报告：

一
、分离与培养
：

1、无菌条件下，取出1-3d 龄SD大鼠心房组织，然后用PBS将此组织块清洗2次
，将组织剪成1mm3左右大小；

2
、往组织块中加入4 mL酶消化液（0.1% 和0.1% I型胶原酶），混悬10s，置37℃条件下消化10min，之后用滴管吹打制成单细胞悬液，自然沉淀并收集上清，用含10% FBS培养基终止消化后4℃放置；

3
、剩下的组织再加入3～4mL酶消化液，混悬10s，置37℃消化10 min后，按上述方法收集上清并终止消化后4℃放置，重复此步骤2-3次，直至组织被消化；

4、用200目不锈钢筛网过滤细胞消化液，1200r/min 离心10min，弃去上清，沉淀细胞用含有10％ FBS DMEM/F12培养基混悬，接种于25cm2培养瓶，放置于37℃ ，5％CO2 培养箱中培养；

5、差速贴壁1h后
，吸出培养基，按实验需要接种于6孔板中继续培养；二
、免疫荧光鉴定：

1
、待心房肌细胞生长至80%融合时，弃去培养基，用温育的PBS冲洗细胞2次，每次10min，然后用4%多聚甲醛在室温条件下固定细胞15min；

2、PBS冲洗细胞2次
，每次10min，然后在4℃条件下，用0.1％Triton X-100透膜15min；

3、PBS冲洗细胞2次
，每次10min
，然后在室温条件下，用4% BSA封闭细胞30min
；

4、按1: 100的比例稀释α-actin一抗，然后将其放在4℃冰箱中孵育细胞过夜；

5
、PBS冲洗细胞3次，每次10min
，按1
：150的比例稀释抗α-actin的二抗， 37℃条件下放置1h；

6、用PBS冲洗3次
，每次10min，在倒置荧光显微镜下观察图像并拍照。

细胞简介：

大鼠结肠黏膜上皮分离自结肠组织
；结肠在右髂窝内续于盲肠，在第3骶椎平面连接直肠。结肠分升结肠

、横结肠、降结肠和乙状结肠4部分，大部分固定于腹后壁，结肠的排列酷似英文字母“M"
，将小肠包围在内。结肠横切面由内到外依次为：黏膜（上皮层、固有层、黏膜肌层），黏膜下层（疏松结缔组织），肌层（内环形、外纵行两层平滑肌），外膜（纤维膜或浆膜）。肠黏膜上皮细胞是机体内外环境的重要屏障

，持续暴露于大量抗原中，也是机体面对病原微生物的道防线。因此，肠黏膜上皮细胞除有吸收、分泌和转运等重要生理功能之外
，在黏膜先天性和获得性免疫防御机制中也起着重要作用
。肠黏膜上皮细胞作为首先接触抗原的细胞，在黏膜免疫反应的起始阶段发挥关键作用，它决定黏膜免疫反应的发生、性质和强度

。探讨正常结肠黏膜上皮细胞的分离、体外培养方法，为研究肠黏膜上皮细胞以及与肠黏膜相关疾病建立合适的细胞模型。

方法简介
：

公司实验室分离的大鼠结肠黏膜上皮采用先机械分离法、后胶原酶消化法并通过上皮细胞专用培养基培养筛选制备而来，细胞总量约为5×10?cells/瓶
。

质量检测

公司实验室分离的大鼠结肠黏膜上皮经Cytokeratin-18免疫荧光鉴定
，纯度可达90%以上，且不含有HIV-1
、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌等
。

培养信息：

包被条件 鼠尾胶原Ⅰ（2-5μg/cm2）

培养基 含FBS、生长添加剂

、Penicillin、Streptomycin等

换液频率 每2-3天换液一次

生长特性 贴壁

细胞形态 上皮细胞样

传代特性 可传1-2代

消化液 0.25%

培养条件 气相：空气，95%；CO2，5%

注意事项：

1. 收到细胞后首先观察细胞瓶是否完好，培养液是否有漏液、浑浊等现象，若有上述现象发生请及时和242net必赢联系。

2. 仔细阅读细胞说明书，了解细胞相关信息，如细胞形态、所用培养基
、血清比例、所需细胞因子等，确保细胞培养条件一致
，若由于培养条件不一致而导致细胞出现问题
，责任由客户自行承担。

3. 用75%酒精擦拭细胞瓶表面，显微镜下观察细胞状态。因运输问题，部分细胞由于温度变化及剧烈碰亡破碎形成碎片
，是正常现象
。观察好细胞状态后
，75%酒精消毒瓶壁将T25瓶置于37℃培养箱放置4-6h
。

4. 贴壁细胞可以消化
，悬浮细胞直接混匀收集细胞，900 rpm-1000 rpm离心3 min

，弃上清。加5 mL PBS重悬细胞，再900 rpm-1000 rpm离心3 min，
，用新鲜的*培养基重悬细胞，并接种到新的培养瓶或培养皿中
，置于培养箱中进行培养。

5. 请客户用相同条件的培养基用于细胞培养。

6. 建议客户收到细胞后前3天各拍几张细胞照片，记录细胞状态，便于和我司技术部沟通交流。由于运输的原因，个别敏感细胞会出现不稳定的情况，请及时和242net必赢联系，告知细胞的具体情况，以便242net必赢的技术人员跟踪回访直至问题解决
。

7. 该细胞仅供科研使用
。

8. 备注：运输用的培养基(灌液培养基)不能再用来培养细胞
，请换用按照说明书细胞培养条件新配制的*培养基来培养细胞
。收到细胞后次传代建议1
：2传代 
。

9.注意： 1:2传代就是1个T25瓶传2个T25瓶或者2个6cm皿。不是1个T25瓶传2个10cm皿
。

公司正在出售的产品
：

大鼠酶原颗粒膜糖蛋白(GP2)检测试剂盒 ，英文名
： GP2 ELISA Kit

Mouse insulin like growth factor 2 (IGF-2) ELISA Kit 小鼠胰岛素样生长因子2(IGF-2)检测试剂盒

RatAmylinELISAKit 大鼠胰淀素(Amylin)检测试剂盒 96T/48T 进口分装

CLIAKitforGelsolinELISAKit大鼠凝溶胶蛋白

细胞甘油三酯(iglyceride)含量酶连续循环反应比色法定量检测试剂盒20次

Ratsolubleclusterofdiffereiation14,sCD14ELISAKit大鼠可溶性CD14(sCD14)检测试剂盒规格：96T/48T

HA重组甲型流感 H15N2 (A/Australian shelduck/Western Australia/1756/1983) 血凝素HA1 (Hemagglutinin) 蛋白 Protein

PAI-1 纤溶酶原激活物抑制因子 0.5mgPAI-1 纤溶酶原激活物抑制因子

ICOSLG重组人 ICOS Ligand / B7-H2 / ICOSLG 蛋白 Protein

ESM1 Protein Human 重组人 ESM1 / Endocan 蛋白

ANGPT2 Protein Human 重组人 Angiopoietin-2 / ANG2 蛋白 (Fc 标签)

PAI-1 纤溶酶原激活物抑制因子 0.5mgPAI-1 纤溶酶原激活物抑制因子

ESM1 Protein Human 重组人 ESM1 / Endocan 蛋白

HA重组甲型流感 H15N2 (A/Australian shelduck/Western Australia/1756/1983) 血凝素HA1 (Hemagglutinin) 蛋白 Protein

ANGPT2 Protein Human 重组人 Angiopoietin-2 / ANG2 蛋白 (Fc 标签)

ICOSLG重组人 ICOS Ligand / B7-H2 / ICOSLG 蛋白 Protein

小鼠坏死因子α(TNF-α)ELISA 试剂盒 96T/48T

Human platelet aibody IgG/M/A (PA-IgG/M/A) ELISA Kit 人抗血小板抗体IgG/M/A(PA-IgG/M/A)检测试剂盒

Humandeubiquitinatingenzyme,DUBELISAKit 人泛素分解酶(DUB)检测试剂盒 96T/48T 进口分装

CLIAKitforABP(HumanAndrogenBindingProtein)ELISAKit人雄激素结合蛋白

合成酶(NOS)总活性终点比色法定量检测试剂盒50/100次

MouseN-terminalpro-brainnaiureticpeptide,-proBNPELISAKit小鼠N端前脑素(-proBNP)检测试剂盒规格：96T/48T

大鼠结肠黏膜上皮细胞小鼠癌标志物CA125ELISAKit   ELISA.   96T/48T

小鼠癌标志物-CA153ELISAKit   ELISA.   96T/48T

小鼠胃肠癌标志物CA199ELISAKit   ELISA.   96T/48T

小鼠血红素氧合酶1(HO-1)ELISAKit   ELISA.   96T/48T