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可用作ELISA测定的标本非常广泛，体液（如血清）
、分泌物（唾液）和排泄物（如尿液、大便）等均可作标本以测定其间某种抗体或抗原成份。有些标本可直接进行测定（如血清、尿液）

，有些则需经预处理（如大便和某些分泌物）

。大多数ELISA检查均以血清为标本。血浆中除尚富含纤维蛋白原和抗凝剂外，其他成份均同等于血清。制备血浆标本需借助于抗凝剂
，而血清标本只需待血清自然凝结、除特别情况外，在医学查验中均以血清作为检查标本
。在ELISA中血浆和血清可同等使用。
血清标本可按常规办法收集，应留意防止溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以HRP为符号的ELISA测定中，溶血标本也许会添加非特异性显色。
血清标本宜在新鲜时检查。如有细菌污染

，菌体中也许富含内源性HRP，也会发作假阳性反应
。如在冰箱中保留过久
，其间的可发作聚合，在间接法ELISA中可使本底加深
。通常说来，在5天内测定的血清标本可放置于4℃，超越一星期测定的需低温冰存。冻住血清融解后，蛋白质部分浓缩，分布不均，应充沛混匀宜轻缓，防止气泡，可上下颠倒混和
，不要在混匀器上强烈振荡
。混浊或有沉淀的血清标本应先离心或过滤，澄清后再检查
。重复冻融会使抗体效价下跌，所以测抗体的血清标本如需保留作多次检查，宜少数分装冰存。保留血清自收集时就应留意无菌操作，也可参加恰当防腐剂。