（一）AP的底物
AP为磷酸酯酶，一般采用对硝基苯磷酸酯(p-nitrophenylphosphate,p-NPP)作为底物 ，可制成片剂 ，使用方便。产物为黄色的对硝基酚 ，在405nm波长处有吸收峰。用NaOH终止酶反应后，黄色可稳定一时间。
AP也有发荧光底物（磷酸4-甲基伞酮） ，可用于ELISA作荧光测定 ，敏感度较高于用显色底物的比色法。
（二）ELISA试剂盒HRP的底物
HRP催化过氧化物的氧化反应，代表性的过氧化物为H2O2 ，其反应式如下 ：
DH2+H2O2D+H2O
上式中，DH2为供氧体，H2O2为受氢体。在ELISA中，DH2一般为无色化合物 ，经酶作用后成为有色的产物，以便作比色测定。常用的供氢体有邻苯二胺(O-phenylenediamine,OPD) 、四甲基联苯胺(3,3,5,5-tetramethylbenzidine,TMB)和ABTS[2,2-azino-di-(3-ethylbenziazobinesulfonate-6)] 。
OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在492nm处有zui高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是HRP结合物zui常用的底物 。OPD本身难溶于水，OPD·2HCl为水溶性。曾有报道OPD有致异变性 ，操作时应予注意。OPD见光易变质 ，与过氧化氢混合成底物应用液后更不稳定 ，须现配置现用。在试剂盒中 ，OPD和H2O2一般分成二组分，OPD可制成一定量的粉剂或片剂形式，片剂中含有发泡助溶剂，使用更为方便。过氧化氢则配入底物缓冲液中，有制成易保存的浓缩液 ，使用时用蒸馏水稀释。先进的ELISA试剂盒中则直接配成含保护剂的工作浓度为0.02%H2O2的应用液,只需加入OPD后即可作为底物应用液。
TMB经HRP作用后共产物显蓝色，目视对比鲜明。TMB性质较稳定 ，可配成溶液试剂，只需与H2O2溶液混和即成应用液，可直接作底物使用。另外，TMB又有无致癌性等优点，因此在ELISA中应用日趋广泛。酶反应用HCL或H2SO4终止后 ，TMB产物由蓝色呈黄色，可在比色计中定量 ，zui适吸收波长为405nm 。
ABTS虽不如OPD和TMB敏感 ，但空白值极低，也为一些ELISA试剂盒所采用。
另一种HRP的底物为3-(4-羟基)苯丙酸[3-(4-hydroxy)phenlypropionicacid,HPPA]，经HRP作用后 ，产物显荧光，可用荧光光度计测量。用于ELISA的优点为可加宽定量测定的线性范围。
HRP对氢受体的专一性很高，仅作用于H2O2、小分醇的过氧化物和尿素过氧化物(ureaperoxide)。H2O2应用zui多，但尿素过氧化物为固体，作为试剂较H2O2方便、稳定 。试剂盒供应尿素过氧化物片剂，用蒸馏水溶解后 ，在底物缓冲液中密闭、低温（2～8℃）可稳定1年。